在微生物制药过程中，目的基因或蛋白在大肠杆菌或酵母菌等微生物表达系统中发酵表达，在后续提取目的产物时不可避免会涉及到的一个环节就是细胞破碎，而在日常工艺中高压均质法是这个步骤中常见的操作，高压均质机用于进行细胞破碎，在不使用溶剂或化学品破碎细胞壁的情况下，从酵母和细菌中提取酶、蛋白等细胞物质。就像游戏里的打怪升级、天梯进阶一样，创新药的研发与生产是一个漫长的旅程，但经过时间积累终会有所成就，希望通过我们分享的攻略能让大家在研发过程中的段位持续提高，成为自己的大神。我们将在此给大家分享生物医药CMC流程中实际操作的各种心得体会，今天给大家分享的是高压均质机在生物制药中的使用要点。
均质机种类：①高压（高压作用下物料高速喷射）、②高剪切分散（高速运动形成高剪切力）、③（产生气泡并闭合形成的能量）、④研磨（用高速运动的钢珠等研磨样品）、⑤拍打均质（拍打撞击等外部机械力量）。在微生物领域中最常用的是高压均质机。
高压均质机自1900年在巴黎世博会上展出以来，已经有100多年的历史了。从最早的食品乳化行业，到现在的生物细胞破碎行业，再到药物制剂的脂肪乳、脂质体、纳米粒项目，以及化工、化妆品等，可以说渗透进了各行各业，而在这些所有的高压均质机里面，均质阀式的高压均质机出现得最早，也是目前为止市面上最主流的高压均质机。
高压均质机是由一个高压柱塞泵及特殊构造的均质阀组成，物料在柱塞的往复运动的作用下，输送到一个大小可调的阀组中，受到极强的压缩作用，在通过限流狭缝时，以极快的速度撞击在均质阀并以极高的流速喷出（1000m/s，高可达1500m/s）， 产生空穴效应，撞击效应和剪切效应，使团聚的物料均匀分散。
空穴效应：被柱塞紧缩的物料内积聚了极高的能量，经过可调理限流缝隙时霎时失压，形成高能释放惹起空穴爆炸，致使物料激烈粉碎细化。（主要应用于均质）
撞击效应：经过可调理限流缝隙的物料以上述极高的速度，撞击到用特殊资料制成的的冲击环上，形成物料粉碎。（主要应用于细胞破碎）
剪切效应：高速物料经过泵腔内通道和阀口狭缝时会产生剪切效应。被三种效应处置过的物料可平均细化到0.03μm-2μm粒径。（主要应用于乳化）
目前市面上的均质机品牌主要有ATS均质机、GEA均质机、Genizer均质机等，基于同一原理的不同品牌的均质机效果不尽相同，而耀海生物选择的是ATS均质机和GEA均质机，力求达到最完美的均质效果，为客户的产品“保驾护航”。
大肠杆菌胞内表达形式，使用均质机处理使目的蛋白表达出来。目前耀海生物现有ATS（100L/h）、GEA（1000L/h）两种规格均质机，基于处理不同的体积选择不同的均质机。
①开机准备 首先检查电动机转动方向和传动箱内润滑油的油位。开启冷却水，保证调压手柄处于旋松完全无压力状态（放松手柄1~2圈)，打开进料阀和出料阀。
②启动 主电动机，在无负荷的情况下运转几分钟，使设备各部件能充分润滑，同时可将泵体内空气排尽。待出料口出料正常后，旋动调压手柄。先缓慢调节二级调压手柄，再调节一级调压手柄，缓慢将压力调至使用压力。
③关机 先缓慢放松一级调压手柄,再缓慢放松二级调压手柄卸压,当压力为零时再关主电动机，最后关冷却水。
②启动设备前应检查爷紧固件及管路等是否紧固。启动前应先接通冷却水，保证柱塞往复运动时能充分冷却。
1、均质操作由于通过压力增加达到破碎效果，过程中温度上升。小试阶段均质机通过增加制冷设备，可以将温度控制在理想状态（如2℃-8℃）。放大生产时，设备体积变大，温控效果较难完全重现小试数据，需要依据蛋白稳定性情况评估操作的可行性；
2、均质后，蛋白混悬液成分比较复杂，部分能使蛋白降解的酶释放出来，因此从均质执行开始至捕获层析结束，工艺时长要严格控制，降低蛋白降解风险。
3、设备性能差异可能导致最终均质效果不一致，进而导致后续工艺受到挑战。因此要求在放大生产过程中慎重选择小试设备规定的工艺参数（如均质压力及次数）。例如：小试设备性能低于放大生产设备性能，放大按照小试参数执行，导致均质效率变高，菌体碎片变小（类似破壁料理机），后续澄清工艺无法成功拦截菌体碎片，澄清后浊度依旧较高，最终导致捕获层析阶段工艺压力较大，工艺重现风险较大。因此在放大生产阶段，需要充分评估小试与放大生产设备差异性，也需要依据过程中镜检观察活菌数量（经验）来评判均质效果，进而确认均质压力及次数等工艺参数。
某项目粗纯工艺路线为：菌体重悬→均质→离心→过滤→捕获层析→……在均质阶段出现一些状况。小试工艺：采用ATS均质机，均质压力800-900ba、均质3次。放大生产工艺：采用GEA均质机，均质压力800-900bar、均质3次，镜检破碎率合格。但后续离心工艺无法分离菌体碎片，过滤后菌体浊度＞5000NTU，浊度远超小试过滤后结果（500~1000NTU）原因分析：1、设备性能发生变化，生产所用GEA均质机性能优于小试设备ATS均质机，按照小试工艺执行生产，料液过度破碎，杂质粒径变小，导致后续工序失效；2、小试摸索出工艺范围较窄，放大生产时参数区间选择性不强，按照工艺参数操作无法线性放大。
1、小试需要遵循QbD原则，设计之初应该给出足够大的操作区间，以应对放大生产中可能存在的风险。
星耀小TIP：QbD，意即质量源于设计(Quality by Design)，是近年为业内推崇的系统研究方。简单而言，QbD始于预设的目标去进行分离实验，同时研究多个变量及其相互影响，从而得到对方法的充分了解，在此基础上选择符合预期的方法再进行验证。过程中涉及以下概念：
实验设计(DoE, Design of Experiment):针对影响过程和过程输出的因素，系统地、有条理地测定其彼此的关系。
知识空间(Knowledge Space):从研究过程中得到的信息与知识以及相应的科学理解，用于支持设计空间的建立。
设计空间(Design Space):引入变量和过程参数的组合及其相互作用，确保能够提供预期的方法性能。
2、小试与大生产使用同一厂家均质机设备，一定程度上可以规避因设备性能差异引起的均质效果不同的风险。3、均质生产过程中，每次均质完成后，使用显微镜观察破碎效率，当破碎率达到95%即可判定均质操作完成，不再继续破碎，避免杂质破碎程度过高难以与目标产物分离，给后续纯化分离步骤带来严重干扰。
星耀小TIP：非常值得注意的是，放眼整个微生物制药行业，方案2几乎是很难实现的。小试大多使用ATS均质机，因为小试阶段对目的产物的要求是远远低于放大生产阶段的，ATS均质机因其性能已经足够满足GMP要求，已经能够生产出符合质量标准的目的产物，此时对设备的考量重点放在其灵活性和节省成本上。
但若发酵液放大规模在1000-2000L，则GEA均质机才是最佳选择。GEA均质机作为意大利进口机械，其性能（流速、压力等稳定性性能远远高于ATS均质机），最重要的是，在FDA方面GEA均质机完全满足其规定，但ATS均质机则有点“难以望其项背”的意味了。
不过话说回来，“成也萧何，败也萧何”，GEA均质机破碎效果更佳是不争的事实，但若破碎过细导致杂质破碎程度也同目的产物一样，则难以将二者区分开来，后续纯化步骤也难以开展。这是曾经遇到过的案例，如今面对这样的“事故”处理起来已游刃有余。的确，可以通过镜检的方式在观察到细胞破碎率达95%即可停止操作，但最好的方式仍然是在小试阶段设计工艺时给出足够的参数设置范围，给予更多操作空间，同时再和后续生产放大的镜检相互配合，首尾呼应，才能更好地缩短项目时间，提高药物研发进程，避免失败后的返工操作。
ATS均质机和GEA均质机都有其优势使得它们在众多均质机中脱颖而出成为现在微生物制药行业中的主流。
ATS均质机在能量最大点爆破，可以实现比普通均质阀高30%的爆破力，在速度最高点撞击挡圈，可以实现比普通阀高40%的撞击力；
GEA均质机进口器械，通过ISO 9001:2008质量体系的认可，并完全遵守所有药品的要求和规定，而且机械运行时间较长，维护成本非常低。
但再次提醒各位，小试转放大生产并不是一个简单的线性放大过程和简单的工艺转移，所谓“走一步看三步”，需要在小试阶段就将生产端的设备设施条件等纳入考虑范围，提前设置好较为灵活的参数范围，给放大端留有可操作空间的余地，这也是本文的重点内容，希望帮助大家少走弯路。
【2】高压对蛋白质结构和酶解及功能性质的影响研究进展[J]. 李凤,魏明,吴照民,韩珍琼. 安徽农业科学.
【3】 乔智. 基于高压均质技术的小分子动物胶原蛋白制备方法研究[D].哈尔滨工业大学,2015.
耀海生物，作为中国生物医药产业蓬勃发展的亲历者和见证者，深耕微生物表达体系CDMO服务多年，业务聚焦在“重组蛋白/多肽、质粒/mRNA、纳米抗体、新型重组疫苗”等领域，致力于打造CRO/CDMO/MAH开放式、全方位、一体化的产研服务平台。
用心服务，共创未来。十年来，耀海生物坚持创新发展，坚定不移走在不断提高和完善研发、生产、质量管理与控务体系的道路上，以平台技术构筑实力底蕴，并以全面的服务能力、丰富的项目经验及规模领先优势，为国内外制药公司提供从工艺开发到商业化生产的全生命周期CDMO服务，助推客户新药项目顺利推进，为中国生物医药产业发展持续赋能。
